Лабораторная диагностика сифилиса (4)

Иммуноферментный анализ

  Иммуноферментный метод диагностики (ИФА) для выявления антител класса IgG к антигенам Т. pallidum был разработан в 1985 г. Farshy, Hunter с соавт. Принцип метода заключается в выявлении сорбированного на твердой фазе (поверхность лунок пластикового планшета) специфического комплекса "антиген - антитело" антиглобулиновыми антителами, мечен­ными ферментом (пероксидазой), с помощью цветной реакции с субстра­том, учитываемой количественно спектрофотометрически.

Антигены, применяемые для сенсибилизации планшета, могут быть:

- лизатными - полученными в результате лизиса или разрушения уль­тразвуком Т. pallidum;

 - рекомбинантными - полученными с помощью методов генной инжене­рии - белки, несущие антигенные детерминанты, идентичные Т. pallidum;

 - пептидными - полученными в результате химического синтеза фраг­ментов белков Т. pallidum, имеющих антигенную реактивность, анало­гичную исходным белкам возбудителя.

   ИФА подразделяется на гомогенный и гетерогенный. В основе гомоген­ного ИФА, применяемого для определения низкомолекулярных субстанций (гаптены), лежит ингибирование активности фермента при соединении его с гаптеном (активность фермента восстанавливается в результате реакции "антиген - антитело") либо, наоборот, потеря активности маркерного фер­мента в результате реакции "антиген - антитело". Удаление антигена из сме­си, содержащей антиген в связанном виде, в составе иммунных комплексов, невозможно. В противоположность этому при гетерогенном ИФА антиген или антитело фиксируется на твердой фазе (как правило, пластике), а непрореагировавшие компоненты реакции удаляются многократным отмы­ванием.

  В лунки сенсибилизированного антигенами планшета помещают ис­следуемые сыворотки и инкубируют. При наличии специфических трепонемных антител они связываются, образуя комплекс "антиген - антитело" остающийся на пластике после отмывки несвязавшихся иммуноглобули­нов. Регистрация реакции осуществляется с помощью антител к иммуноглобулинам человека, чаще всего анти-IgG и анти-IgM, меченных пероксидазой (конъюгат). После присоединения конъюгата к комплексу "антиген - антитело" и отмывки несвязавшегося конъюгата в лунки до­бавляют субстрат для фермента, в случае пероксидазы - раствор переки­си водорода, содержащий какой-либо хромоген - химическое соединение, которое в процессе окисления выделяющимся атомарным кислородом при ферментативном расщеплении перекиси водорода дает окрашенные про­дукты, концентрацию которых можно измерить спектрофотометрически. Чаще всего в качестве хромогена используют орто-фенилендиамин, тетраметилбензидин.

  Качество иммуноферментных тест-систем зависит от многих факто­ров, но в первую очередь от качества использованного антигена, от того, насколько используемый антиген иммуногенен, т. е. от того, насколько пол­но представлены в нем антигенные детерминанты, на которые организм больного вырабатывает значительное количество антител на разных ста­диях болезни. Чтобы избежать ложноположительных реакций, используе­мые в ИФА антигены не должны давать перекрестных реакций с групповыми антигенами спирохет, а также с антителами другой специфичности, не имеющими отношения к Т. pallidum.

  Следующий фактор, определяющий качество ИФА-наборов, это каче­ство конъюгата - препарата антител к отдельным классам иммуноглобули­нов человека, меченных ферментом. Использование для получения конъю­гата моноклональных антител к иммуноглобулинам человека снижает уровень неспецифических реакций.

  В 1989 г. в работе О. Ijsselmudien с соавт. был предложен метод ловушечного ИФА для выявления антител класса IgM к антигенам Т. pallidum, об­ладающий высокой специфичностью и чувствительностью. В ловушечном ИФА на поверхности лунок планшета сорбированы очищенные антитела к иммуноглобулинам человека класса IgM. В результате инкубации иссле­дуемой сыворотки все IgM связываются с носителем. Наличие среди свя­занных IgM специфичных для антигенов Т. pallidum выявляется с помощью антигенов Т. pallidum, конъюгированных с ферментом.

  Чувствительность ИФА составляет 98-100%, специфичность - 96-100%.

  Особые преимущества ИФА заключаются в высокой чувствительно­сти и специфичности метода, автоматизации постановки реакции, высокой степени стандартизации, возможности исследования большого количества образцов сывороток, количественном учете и объективной документации полученных результатов, возможности одновременного определения тит­ра противотрепонемных антител различных классов (IgG и IgM) в одном образце, пригодности для ранней диагностики сифилиса и диагностики врожденного сифилиса, удобстве применения для тестирования крови в службе переливания крови, применимости в качестве подтверждающего специфического трепонемного теста.

  К недостаткам ИФА можно отнести: непригодность для исследования единичных образцов; более длительный срок до получения результата, на­пример в сравнении с РПГА; меньший срок годности ИФА-наборов, напри­мер в сравнении с РПГА.
 

  В России применение ИФА регламентировано приказом Минздрава России от 07.12.1993 № 286 "О совершенствовании контроля за заболева­ниями, передаваемыми половым путем", информационным письмом Минздравмедпрома России от 01.12.1995, Приказом № 87, а также отдельными приказами по службе крови.